Elektrophorese, Zetapotential und Brownsche Diffusionsgröße nach ersten Prinzipien

Mit dem ZetaView® Einzelpartikel Tracking sind die klassische Mikroelektrophorese und die Brownsche Diffusion in die moderne Partikelmesstechnik gerückt. Autojustage und Autofokus machen das „Seeing is believing“ – Prinzip für die Nanopartikel Charakteriserung benutzerfreundlich. Zetapotential- und Größenhistogramme setzen sich aus der Analyse von tausenden einzelner Partikel zusammen. Zusätzlich können Partikelkonzentrationen bestimmt werden. Die Handhabung der Messzelle ist auf wenige Handgriffe reduziert. Anwendungen gibt es in den Bereichen: Proteine, Mikrovesikel, Exosomen, Coatings, Emulsionen, Füllstoffe, Lebensmittel & Getränke, Keramik, Kolloide, Pigmente, Polymere, Schleif- und Poliermittel, Silica, Tinten, CNT Kohlenstoff-Nanoröhrchen, neue Materialien generell, Gold und Silbersole u.v.a. mehr.

ZetaView®
ZetaView® - Autoscan über bis zu 100 Subvolumen - Autofokus - Gerät passt in einen Pilotenkoffer - Antivibrationsdesign - Laser von UV bis rot - Slide-in Zellkassette
ZetaView Nanopartikel Tracking
Abb. 1: Verfolgung der Bewegung von Einzelpartikeln

Merkmale des ZetaView®

Automation und passive Stabilität

ZetaView Einschubkassette
Foto: Einschub-Zellkassette mit Probenzellträger auf der Oberseite

Nach einem “AutoAlignment” bleibt das ZetaView für Tage hinaus justiert, selbst nach Entfernung der Zelle. Das Antivibrationsdesign erhöht die Stabilität des Videobildes. Durch Abtastung multipler Sub-Volumen und Mittelung der Messungen, sind statistisch robuste Ergebnisse garantiert. Drei Messmodi stehen zur Verfügung: Größe, Zetapotential und Konzentration. Eine unsymmetrische Beschichtung der in Beobachtungsrichtung befindlichen Zellwände zum Beispiel durch Sedimentation kommt wegen der vertikalen Orientierung des Zellkanals nicht vor (Abb. 2). Der Zellkanal ist in einer Einschubkassette integriert (Foto), die mit einer Temperaturkontrolle und Schnappverbindungen ausgestattet ist. 

Theorie

Aus der direkten Beobachtung der Brownschen Bewegung der Partikel wird die Diffusionskonstante vieler einzelner Partikel bestimmt und mit Hilfe der Stokes-Einstein Beziehung in hydrodynamische Partikelgröße umgerechnet. Aus der Messung der elektrophoretischen Mobilität wird das Zetapotential errechnet.

ZetaView® Nanopartikel Tracking Analyse (NTA)
Partikelgröße durch Brownsche Bewegung: Nanopartikel Tracking Analyse (NTA)
ZetaView® Prinzip der Zetapotentialbestimmung
Prinzip der Zetapotentialbestimmung

Nanopartikel Tracking Analyse (NTA) und Dynamische Lichtstreuung (DLS)

Alle Lichtstreuungsgeräte – Nanopartikel Tracking eingeschlossen – leiden an der rapide sinkenden Empfindlichkeit unterhalb 100 nm. Die kleinste messbare Größe für die DLS Dynamische Lichtstreuung liegt bei ~ 0,5 nm, für Nanopartikel Tracking Analyse ~ 10 nm. Im Allgemeinen liegt der Hauptunterschied zwischen DLS und NTA im Konzentrationsbereich. Wenn die Konzentration für DLS zu niedrig ist, erledigt der ZetaView® Nanopartikel Tracking Analysator die Aufgabe brilliant und schnell. Umgekehrt ist das 180° DLS System ideal zur Analyse von hochkonzentrierten Proben.

Messbereich

Abhängig von Probe und Geräteausstattung mit Laser und Kamera ist das direkte Tracking ab 10 nm aufwärts möglich. Solange die Probe nicht sedimentiert, liegt die obere Messgrenze für die Elektrophorese bei 20 μm. Die Diffusionsgröße ist nach oben hin auf 3 μm begrenzt. 

Partikelzählung im bekannten Streulichtvolumen

Die Partikelkonzentration wird aus der Analyse der Video-Frames für die beobachtete Partikelanzahl erhalten. Die Partikelkonzentration wird bezogen auf das messbare Streulichtvolumen. Eine Mindestkonzentration von 105 Partikeln pro cm³ kann detektiert werden, das Maximum liegt bei 1010 p/cm³. In einer Volumenkonzentration, können bis zu 1000 ppm 200 nm großer Partikel analysiert werden.

Genauigkeit und Präzision

Für das Zetapotential, liegt die Genauigkeit bei 5 mV, die Präzision bei 4 mV und die Wiederholbarkeit von Gerät zu Gerät bei 5 mV. Für die Größenbestimmung einer 100 nm Standard Latexsuspension liegt die Genauigkeit bei 6 nm für Anzahlverteilungen, die Präzision bei 4 nm und die Wiederholbarkeit von Gerät zu Gerät bei 4 nm. Für 100 nm Partikel bei einer Konzentration von 10 Millionen Partikeln/mL liegt die Genauigkeit bei 0,8 Mio/mL und die Präzision bei 0,5 Mio/mL. Die Wiederholbarkeit von Gerät zu Gerät liegt bei 1 Mio/mL. Alle aufgeführten technischen Daten gelten unter der Voraussetzung der korrekten optischen Einstellungen. 

Die Methode

Die Empfindlichkeit des ZetaView® Laser-Streulicht-Mikroskops für Nanopartikel liegt 100-fach unter der Beugungsgrenze von  ~ 1µm (Abb. 2).

Optisches Layout des automatisierten Partikel-Trackings im ZetaView®
Abb 2: Optisches Layout des automatisierten Partikel-Trackings im ZetaView® Laser-Lichtstreu-Mikroskop mit Autofokus. Kein Wechsel der Mikroskopoptik erforderlich.

Flexibilität

Das Gerät ist kompakt und kann in einem Pilotenkoffert transportiert werden. Set-Up in wenigen Minuten. Es kann in einem Netzwerk oder „Standalone“ betrieben werden.

Qualität der Messungen

Die Qualität der Daten kann durch Blasen oder Schmutz in der Zelle beeinflusst werden, daher wird eine statistische Auswertung der Bildqualität vorgenommen.  Das Bild der Partikel wird auf die Videokamera fokussiert. Aus der Messung der Partikelgeschwindigkeit und -richtung unter einem angelegten elektrischen Feld wird die elektrophoretische Mobilität und Polarität bestimmt. Ohne Berücksichtigung eines Feldes wird nur die Brownsche Bewegung erfasst. Elektrisches Feld, Temperatur und Leitfähigkeit werden ebenfalls bei jedem Versuch überwacht. Durch Abtastung des Zellquerschnitts und Sequenzierung der Subvolumen können exzellente statistische Ergebnisse erzielt werden.

ZetaView® für Zetapotential UND Qualitätskontrolle

Die Zetapotentialverteilung wird aus den Ergebnissen der elektrophoretischen Mobilität an den 2 stationären Schichten in der Zelle (ζ-layer“ / “ZP”, Abb. 3) oder aus einem elektrokinetischen Geschwindigkeitsprofil mittels Abtastung durch die gesamte Zelle berechnet. Mit Hilfe der Smoluchowski bzw. Henry – Formel wird das Zetapotential berechnet. (siehe “Theorie”). Zusätzlich zum Ergebnis des Partikel-Zetapotentials liefert die Krümmung eines Profils unabhängige Information über die Polarität und den Anteil ionischer Belegung an den Zellwänden. Beim Umgang mit ultrafeinen Partikeln ist eine Wandbelegung immer vorhanden. Die Korrektheit der elektrophoretischen Zetapotentialbestimmung wird  durch die Wandbelegung nicht beeinflusst.

Abb. 3: Grün: ZP von Al2O3 ist +50 mV, Wände sind kationisch belegt. Rot: -25 mV ZP anionisches Polystyrol, die Wände sind neutral. Blau: Polystyrol -40 mV ZP, Die Wände sind wie bei Glas üblich anionisch geladen.

Zetapotentialverteilungen

Abb. 4a: Zetapotentialverteilung von 60 nm Goldpartikeln. A: In 2 mM KCl Lösung dispergiert (stabil). B: In destilliertem Wasser dispergiert (instabil).
Abb. 4b: Entsprechend zeigt die weniger stabile Probe B koagulierte Objekte.

Einige Beispiele sollen die Leistungsfähigkeit des ZetaView bei der Messung von Zetapotentialverteilungen hervorheben.

Eine 60 nm Golddispersion wurde auf Größe und Zetapotentialverteilung untersucht (Abb. 4a + b). Die Probe ist geringfügig bi-modal.

Kurve A (rot) stellt Goldpartikel in einer 2m KCl Umgebung dar, Kurve B (blau) dieselbe Probe, jedoch in destilliertem Wasser dispergiert.

Die Zetapotentialverteilung von Kurve B zeigt einen Peak nahe 0 mV, was die Suspension instabil macht. Der Großteil der 60 nm Partikel ist daher agglomeriert, deutlich sichtbar an  der Größenverteilung von Kurve B.

Translationale Diffusionsgrößenverteilung

Abb. 5: Größenverteilung (LOQ) von 20 nm BBI Goldpartikeln in destilliertem Wasser.

Für das ZetaView PMX 110 liegt die untere Nachweisgrenze bei 20 nm LOQ (Abb. 5).

Für Substanzen mit niedrigerer Streueffizienz ist das untere Größenlimit entsprechend höher.

Am Beispiel von aus BMBO Zellen gewonnenen Exosomen in einem pH 7 Soerensen Puffer wird die Wechselbeziehung zwischen Leitfähigkeit, Zetapotential und Größenverteilung demonstriert (Abb.6). Die Leitfähigkeit wird während der Datenerfassung automatisch überwacht.

Abb. 6: Die Wechselbeziehung zwischen Leitfähigkeit, Zetapotential und Partikelgrößenverteilung, dargestellt an Exosomen* (siehe Text).