„Particle Metrix - frontier technology - cooperative spirit“
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Fluorescence and electrophoresis NTA at

Biologische Nanopartikel, wie Extrazelluläre Vesikel (EVs), Exosomen, Lipide, Viren oder Proteine finden sich in nahezu allen Flüssigkeiten von lebendem Gewebe. Mit der ZetaView® NTA-Technik von Particle Metrix lassen sich diese zuverlässig in Wasser oder physiologischen Puffern charakterisieren. Mit nur einer einzigen Messung einer Partikelprobe erhalten Sie gleichzeitig Informationen über Partikelgröße, Partikelkonzentration und Oberflächenladung. Ebenso sind Clusteranalysen auf Basis von ähnlichen Eigenschaften möglich.

Die Partikelkonzentration wird über die Anzahl der von der Kamera detektierten Partikel in einem kalibrierten und vom Laser des ZetaView® illuminierten Probenvolumen bestimmt. Sie ist immer apparent und wird als „live read-out“ angezeigt, sobald eine Partikelprobe in das Gerät eingeführt wird, selbst wenn eine Messung noch nicht gestartet wurde. Die Farbkodierung der Konzentrationsanzeige am ZetaView® zeigt, ob die Partikel in der Probe in der optimalen Messkonzentration vorliegen. So kann noch vor der Messung eine Konzentrationsanpassung der Probe erfolgen.

Musterparameter wie Intensität, Flächengeometrie und Form der Partikel sowie deren zeitliche Fluktuationen werden ebenfalls bei jeder Aufnahme festgehalten. Diese können zur Unterscheidung von Subpopulationen, im fcs-Format dokumentiert, herangezogen werden.

Aufgrund der Brownschen Bewegung bewegen sich kleine Teilchen in Flüssigkeit sehr viel schneller als große Teilchen. Jedes einzelne Partikel im Sichtbereich der Kamera wird erfasst und in seiner Bewegung in zweidimensionaler Richtung verfolgt. Die gemessene Ortsveränderung innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls t ergibt für jedes einzelne Teilchen eine spezifische Diffusionskonstante D. Über die Stokes-Einstein Beziehung errechnet das ZetaView® daraus den hydrodynamischen Partikelradius r und damit den Durchmesser jedes Teilchens. Die Ergebnisse werden in einer Partikelgrößenverteilung zusammengefasst und dargestellt.

Was kann die Ladung der Oberfläche von BNPs beeinflussen und wie stark? Es ist bekannt, dass Proteine je nach pH-Wert mehr oder weniger negativ oder positiv geladene Endgruppen aufweisen. Diese Proteine sind mitverantwortlich, dass EVs im Regelfall eine bestimmte negative Ladung aufweisen, welche sich als Zetapotential im Bereich zwischen -30 und -36 mV zeigt. Jede Änderung der Ladung an der Oberfläche, zum Beispiel durch Veränderungen des Proteinbestandes, den Flip von Phosphatidylserin zwischen innerer und äußerer Membran oder durch Anlagerung von gegensinnig geladenen Antikörpern ändert das Zetapotential. Es ergeben sich demnach interessante Möglichkeiten, das Zetapotential als Monitor für Einflüsse an der Partikeloberfläche heranzuziehen. Den Nachweis führt man über ein Elektrophorese-Experiment. Darin setzen sich geladene Partikeln unter Einfluss eines elektrischen Feldes E in Bewegung v. Die gemessene elektrophoretische Mobilität µe = v/E jedes einzelnen Partikels im elektrischen Feld stellt die Basis für die Bestimmung des Zetapotentials dar.

Biologische Nanopartikel, wie extrazelluläre Vesikel, können mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern konjugiert und anschließend im Fluoreszenzmodus des ZetaView® nach Größe, Konzentration und bei Bedarf auch nach Zetapotential und anderen Musterparametern analysiert werden. Die zu analysierenden Partikel müssen dafür hinreichend gut aufgereinigt und die konjugierte Probe von makromolekularen Stoffen sowie restlichen freien Fluoreszenzmolekülen sowie kleinen Proteinpartikeln und Lipiden befreit werden. Es können sowohl Membranfarbstoffe als auch primäre und sekundäre fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet werden. Mit dem Twin-Laser System  können sogar Phenotyping-Experimente an extrazellulären Vesikeln mit einer doppeltgefärbten Probe durchgeführt werden. Hierzu kommen zwei unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe, konjugiert an unterschiedliche Antikörper zum Einsatz, die spezifisch an Tetraspanine (z.B. CD63-Alexa405 & CD81-Alexa488) an der Membranoberfläche binden.

Im Unterschied zur Durchflusszytometrie befinden sich die zu analysierenden BNPs länger im Laserstrahl, im ZetaView® mindestens 0,5 sec. lang. Das bedeutet, die Auswahl photostabiler fluoreszierender Farbstoffe ist wesentlich für die quantitative Auswertung. In der folgenden Abbildung sind einige der Farbstoffe nach ihrer Photostabilität aufgelistet.